生物制品中內毒素檢測方法及去除工藝
更新時間：2025-02-05 點擊次數(shù)：689
內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁的一種脂多糖成分，是一種常見的病原體，細菌在生長、分裂或死亡過程中都會向環(huán)境中釋放內毒素。內毒素是兩親性分子，由親水性多糖部分和共價結合的疏水性脂質成分（稱為脂質A）組成；多糖部分可分為兩個結構域，核心多糖和O特異性抗原多糖，脂質A成分已被確定為內毒素活性的LPS 成分。
生物制品在生產過程中常常會受到細菌內毒素的污染，從而對生物制品造成污染，其存在會嚴重影響生物制品的質量和安全性，進而對人體造成嚴重危害。內毒素通過引發(fā)炎癥和激活免疫系統(tǒng)，導致多種生物學反應，旨在清除入侵的致病菌，但是過度的內毒素暴露或免疫反應失控可能導致嚴重病理生理反應，如發(fā)熱、心動過速、呼吸急促、低血壓、彌散性血管內凝血和多器官衰竭等。因此，如何有效地去除生物制品中的內毒素成為生物制品安全性與質量保障的關鍵。內毒素的結構特征就是去除細菌內毒素的基礎，目前已形成多種內毒素去除工藝，包括超濾法、活性炭吸附法、萃取法、荷電微孔濾膜法、離子交換色譜法和親和色譜法等。
內毒素作用分子機制：
細菌脂多糖是革蘭氏陰性菌的一種膜糖脂，是單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞促炎反應的有效誘導劑，脂多糖結合蛋白（LBP）可與細菌內毒素脂多糖（LPS）直接相互作用形成復合物。CD14是一種單核細胞分化抗原，被確定為 LPS 的主要受體，與LPS 具有高親和力。當血液中有 LPS 時，LPS 與LBP 結合，然后結合細胞表面蛋白 CD14，形成 LBP-LPS-CD14 復合體。CD14 可以將 LPS 轉運到 Toll樣受體 4（TLR4）及髓樣分化蛋白 2（MD2）蛋白復合體，MD2 為 TLR4 的輔助蛋白，可以幫助 TLR4 識別 LPS，TLR4 屬于跨膜蛋白，LPS 與 TLR4-MD2 結合后，TLR4 被激活，使得膜內基團的構象發(fā)生變化，將信號轉到免疫細胞內部，激活髓樣分化因子 88（MyD88）、IL-1R 相關蛋白激酶（IRAK）和腫瘤壞死因子受體活化因子6等信號分子，從而引發(fā) LPS 介導的一系列炎癥反應。
內毒素檢測方法：
內毒素是一種生物類毒素與外源性致熱源，當人體內的內毒素水平超過一定范圍時會對人體造成嚴重危害，所以生物制品的內毒素檢測尤為重要。目前傳統(tǒng)的內毒素檢測方法是家兔熱源法（RPT），即對家兔耳注射一定劑量的供試品后通過監(jiān)測家兔體溫檢測熱源即內毒素，但這種方法不能檢測內毒素含量。鱟試劑試驗法（LAL）也是內毒素的重要檢測方法之一，在領域內被廣泛采用，其原理是內毒素可以激活鱟試劑中的 C 因子、B 因子和前凝固蛋白，而使之變成凝膠狀態(tài)，可以定量或者半定量地檢測內毒素。但是隨著鱟數(shù)量的減少，其他替代方法也相繼出現(xiàn)，如單核細胞活性試驗（MAT）法，該方法的原理為內毒素可以激活人單核細胞釋放白細胞介素-6（IL-6），通過用ELISA 定量檢測 IL-6 進行內毒素的定量分析；生物傳感器是一種對生物性物質敏感并可將其濃度或含量轉換為電信號進行檢測的儀器；重組C因子法也是一種內毒素檢測方法，重組C因子可以被內毒素活化，隨后和熒光底物相互作用產生熒光，通過對熒光信號的檢測實現(xiàn)內毒素的定量分析。此外，還有研究人員采用色譜或色譜-質譜聯(lián)用技術對內毒素進行分析。
內毒素的去除方法：
①超濾法：超濾法是一種分子篩選技術，主要是利用濾膜的特殊結構和性質實現(xiàn)對物質的分離。內毒素相對分子質量較大，適用于去除小分子量物質中的內毒素，選用合適的超濾膜去除溶液中的內毒素。如通常可以選擇截留分子量為10 kDa 的超濾膜對樣品中的內毒素進行去除。超濾法具有操作簡便、處理量大的優(yōu)點，但并不適用于含有較大相對分子質量成分的樣品。②活性炭吸附法：活性炭是一種多孔介質，具有比表面積大、吸附能力強的特性，通過疏水作用對相對分子質量較大的內毒素進行吸附，在弱酸條件下去除效果更好，更適用于小分子溶液或低相對分子質量蛋白質或肽溶液中內毒素的去除。但是活性炭的選擇性較差，對溶液中的活性成分也有吸附作用，并且吸附后溶液中殘留活性炭的去除較為困難，因此目前使用較少。③萃取法：有些生物制品的有效成分為帶負電荷的生物大分子，并且含多糖結構，細菌內毒素不易去除，而萃取法利用目標分子或樣品在兩種互不相溶或微溶的溶劑中溶解度的不同而達到分離目的，因此可以在細菌內毒素去除中應用。如可以用 TritonX-114 對內毒素進行萃取，TritonX-114是非離子表面活性劑，在低溫條件下，可以溶于水中并與內毒素分子結合，在溫度升高的過程中，TritonX-114 的溶解度會逐漸下降，當溫度超過 25 ℃時，TritonX-114會和內毒素一起形成沉淀，實現(xiàn)樣品中內毒素的去除。④荷電微孔濾膜法：荷電微孔濾膜是一種帶有正電荷的濾膜，能夠吸附帶負電荷的物質。細菌內毒素的磷脂部分帶負電荷，因此荷電微孔濾膜可以對其進行吸附，從而達到去除內毒素的目的。需注意使用該方法時內毒素的脫除率與荷電膜的孔徑及溶液的pH有關，需對這些條件進行優(yōu)化已達到最有的脫除效率。⑤離子交換色譜法：內毒素在 pH ＞ 1.3 的情況下帶負電荷，因此可以利用這一原理與陰離子交換色譜發(fā)生相互作用，柱上的內毒素可以用高鹽緩沖液或 NaOH 去除。離子交換色譜法具有成本低、吸附容量大的特點，但若溶液中有效成分存在其他負電荷離子，則不適合采用該方法進行內毒素去除，否則可能會導致有效成分損失。⑥親和色譜法：親和色譜法是通過物質之間的親和作用，運用生物大分子可以特異性識別特定的物質并且進行特異性結合的原理來進行某種物質的分離的方法，此方法對物質的分離主要取決于親和配基，因此選用可以與內毒素分子特異性結合的配基可以達到去除內毒素的目的。研究發(fā)現(xiàn)，以多粘菌素B 、組氨酸、聚賴氨酸、絲氨酸、殼聚糖為配基的親和層析法對細菌內毒素有良好的吸附效果，可以有效去除細菌內毒素。親和層析法因對內毒素有良好的選擇性，因此可有效降低溶液有效分子的損失。各種去除細菌內毒素的方法不是孤立的，可以相互結合使用，在設計整個工藝流程時需要考慮到每一個步驟對內毒素的去除效果以及不同來源樣品的內毒素在性質上的區(qū)別，需要結合工藝流程和特殊性質進行確定。
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